公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：血清血漿 miRNA 提取試劑盒是目前提取小 RNA（<200nt）操作步驟簡單、重復性最好、小 RNA 產 率最高的方法之一。使用該試劑盒通過一步上柱即可獲得高 純度 miRNA，可在 10min 左右完成小 RNA 的提??；且使用 該試劑盒提取的小 RNA（Small RNA）中，長度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA，可 直接用于后續(xù)的反轉錄、Northern 雜交、測序等應用。

儲存：室溫可保存 2 年。
使用防護建議：Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍鹽，其具有強烈的腐蝕性，試驗時請務必佩戴防護眼鏡、手套、口罩等防護措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就醫(yī)。
自備試劑：異丙醇、乙醇、75%異丙醇、2ml EP 管
操作方法：
(1) 向 1.5ml EP 管中加入 800μl Serum/Plasma miRNAReagent。將 300μl 血清或血漿樣本加入到上述 800μlmiRNA Reagent A 中，用腕力混勻 30s,室溫放置 5min。
(2) 13,000rpm 離心5min，將上清約 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 異丙醇，上下顛倒混合均勻。
(3) 將上述溶液分三次加至吸附柱中（每次約 700μl），13,000rpm 離心 15s，倒掉過柱液。
(4) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm離心 15s，倒掉過濾液。
(5) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm離心 15s，倒掉過濾液。
(6) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。
(7) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree H2O，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物即為提取的 miRNA。
常見問題匯總：
(1) 由于血清血漿中的 miRNA 含量極低，提取的 miRNA 濃度通常在 5 ng/μl 以下，因此難以用常規(guī)的 NanoDrop 測量濃度，建議直接使用 10 μl 進行下游反轉錄。由于本試劑盒提取的是小 RNA，該濃度下的 miRNA Copy 數(shù)足以進行下游檢測。
(2) 由于血清血漿中 miRNA 的含量低，為了獲得更可靠的實驗數(shù)據(jù)，建議使用特異性和靈敏度更好的 TaqMan 探針法進行 miRNA 的下游檢測。本試劑盒提取的 miRNA 并不限于其它檢測方法和用途，包括 SYBR Green 法檢測、二代測序、芯片等檢測領域。
(3) 血清血漿 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒為血清血漿專用，不可用于細胞和組織的 miRNA 檢測實驗。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

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